I – Quel est l’intérêt d’isoler une souche de phytoplancton :

Le phytoplancton est très utile dans le cadre d’un élevage de zooplancton, car il constitue la majeure partie de la nourriture des daphnies, artemia, certains copépodes, rotifères etc...Il est utilisé de plus en plus dans les aquariums marins récifaux. C’est une nourriture adaptée aux coraux non symbiotiques, aux gorgones, aux ascidies, aux spongiaires et les lamellibranches filtreurs (ex : Lima). L’intérêt d’isoler une souche est avant tout d’obtenir une souche sauvage sans la présence d’autres organismes ou algues unicellulaires opportunistes, de sélectionner une espèce de phytoplancton en fonction de sa taille, de sa facilité de culture, de son pouvoir de multiplication etc… Je vous propose donc une technique simple de purification d’une souche que vous pourrez garder à long terme.

II – La collecte

Vous avez différentes possibilités :

1) La capture de plancton divers à l’aide d’un filet à plancton au large des côtes ou dans un lac,

2) Se promener à marée basse, en période estivale très ensoleillée et repérer des tâches verdâtres au niveau des zones tidales sablonneuses (pour le phytoplancton marin),

3) Vous pouvez prélever de l’eau d’une mare, dans l’océan, dans une lagune.

Dans les trois cas, il vous faudra du matériel propre réservé qu’à la collecte, les contenants doivent être opaques, la glaciaire est indispensable en cas de forte canicule.





III – La purification :

La purification est identique à celle de tous les micro-organismes unicellulaires, mais se déroule en deux étapes :
_ vous prélevez 1 ml de votre culture. Au microscope, vous verrez une multitude d’organismes présents avec le phytoplancton désiré (à reconnaître). A l’aide d’une cellule de Malassez (plaque de verre quadrillée qui permet de compter un nombre théorique de cellules), vous dénombrez, sous microscope, la densité théorique de votre phytoplancton. Vous rapporterez ce nombre à un volume de 1 à 10 ml de votre milieu. Lorsque vous aurez calculé le nombre théorique de votre phytoplancton dans un volume X d’eau osmosée stérile ou d’eau de mer synthètique stérile (10 minutes au micro ondes, filtration sur filtre de laboratoire), vous procèderez à différentes dilutions pour ne mettre en culture qu’une seule cellule.

Je m’explique :
_ vous avez un millier de diatomées dans 10 ml, donc une centaine dans 1 ml, donc 1 (en théorie) dans 10 µl. Ce qui n’est pas à mesurer précisément.
Si de votre quantité initiale, vous conservez 100 diatomées par ml et que vous ajoutez à ce ml, 9 ml d’eau pure (osmosée stérile ou eau de mer synthétique stérile), vous aurez une concentration de 100 diatomées dans 10 ml, donc 1 diatomée dans 100 µl (ce qui est beaucoup plus simple à prélever). Vous pouvez augmenter la dilution, pour avoir en théorie 1 diatomée pour 1 ml. Ce chiffre est théorique. Dans le cas d'1 diatomée dans 100 µl, si je prélève 100 µl de ma dilution, je peux en théorie prélever 1 diatomée, ou deux diatomées, ou un opportuniste, ou plusieurs ou un peu tout et n’importe quoi etc.
Donc, pour avoir la chance d’avoir une culture pure, il faut avant tout multiplier le nombre de cultures, en plaques de 96 puits de culture. 4 ou 5 plaques de 96 puits sont idéales (vous aurez alors davantage de chances). Dans chaque puits, vous appliquez 100 µl de milieu nutritif (à base d’engrais) stérile et 100 µl de votre dilution. Au bout de 10 jours (24H/24 d’éclairage), vous regarderez vos microcultures sous microscope. Les cultures légèrement « vertes » seront conservées (mais non poolées ensemble, potentiellement non pures, souvent différentes espèces de phytoplancton coexistent), les autres microcultures seront jetées (souvent transparentes). La deuxième étape est de repurifier chacun de vos puits présentant une couleur verte dans de nouvelles plaques de culture. Chaque puits de 200 µl potentiellement intéressant, sera repris et de nouveau dilué dans des tubes à essai : 1er tube : 1,8 ml de milieu stérile (eau osmosée ou de mer synthétique + nutriments (dilution 1/10), 2ème : 9 ml de volume de milieu stérile enrichi en nutriments + 1 ml de la première dilution (dilution 1/10 de la première dilution, donc 1/100 de la solution mère, etc. (gamme de dilution de 10 en 10).

Exemple d'expérimentation ratée (plaque MaxiSorb 96 puits) après 10 jours:




Exemple de plaque réussie après 10 jours, les deux puits clairs constituent un "blanc" sur le milieu (contaminations possibles):


Deuxième purification d'un puits de la plaque ci-dessus:
(seuls quelques puits sont colorés)





Outillage nécessaire (sauf le verre de vin):


IV – Généralités

Le repiquage d’une souche consiste à prélever une fraction d’une souche bien établie et de l’injecter dans un nouveau milieu nutritif. Ce repiquage est nécessaire afin d’éviter la perte d’une souche. En effet, une souche se développe en « ingérant » le milieu initial, se multiplie (la densité augmente) et excrète des déchets qui peuvent être à plus ou moins long terme, toxiques pour les microorganismes. Dans nos systèmes d’élevage fermés (sans échange avec le milieu extérieur), le milieu s’appauvrira rapidement.

V – Notion de « moment de repiquage »

Prenons le cas du phytoplancton. Selon le schéma 1, la densité phytoplanctonique augmentera au détriment de la qualité du milieu nutritif. Une production de déchets organiques contrebalance le milieu. Si la souche est maintenue sans repiquage, elle risque d’être perdue définitivement. Le but de la maintenance est de pouvoir prévoir un repiquage juste avant d’atteindre le plateau de densité. Ce qui permettra, selon le schéma 2, de maintenir de façon continue la souche.



Schéma 1


Schéma 2


VI – Notion de « volume de repiquage »

Le volume de repiquage est très important. En effet, pour une production rationnelle et constante dans le temps, il est nécessaire d’intégrer une fraction constante dans un volume nutritif constant. Dans le cas du phytoplancton, repiquer 1/4 en volume une souche pour un système fermé de moins de 2 litres ou repiquer 1/3 en volume une souche pour un système fermé de plus de 2 litres. La raison de ces rapports est la durée de production et le ratio concentration de nutriments à disposition / densité de la population

VII – Les systèmes « semi ouverts »

Un système efficace consiste à ajouter en continu du milieu nutritif et à rejeter en continu le milieu présent dans la culture, tout en maintenant une densité de population stable dans le temps. Le goutte à goutte remplira parfaitement ce rôle. On injecte du milieu neuf dans le contenant de culture et en même temps, à débit constant et identique à celui d’injection, on retire du milieu de culture du contenant. Dans ce cas, on stabilisera la densité de population, la concentration de déchets organiques issus du métabolisme des microorganismes et l’apport constant de milieu favorisera la richesse nutritive de la culture. L’emploi de pompes péristaltiques est envisageable.


Cet article a été soumis sur Discount-recif et aqua33



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Commentaires

[b]Il y'a un gros problème, Limil, il manque la moitié de l'article et les photographies !!!!!!!!!!!!

Il faut que je retrouve les photos.